Nuevos procesos de separación e identificación de compuestos bioactivos

“Ningún placer dura lo suficiente”. Estas palabras, pronunciadas por el poeta romano Sexto Propercio en el siglo I a.C., hoy día se pueden seguir aplicando a una sociedad actual que cumple tres clichés a pesar del paso de los años. En primer lugar, queremos disfrutar al máximo de nuestra estancia en este mundo. También nos queremos ver guapos durante el mayor tiempo posible y, finalmente, queremos estar lo más sanos posibles.

La industria no es tonta y lo sabe muy bien. Solo hay que ver la cantidad de alimentos y cosméticos que se venden basados en alguno de estos tres principios. Elixires de la eterna juventud, cosméticos que prometen hacernos más jóvenes, complementos alimenticios anti-aging… y no podemos olvidar en esta lista a los fármacos, verdaderos protagonistas del aumento de longevidad de la población mundial. Todos ellos se basan en la presencia de moléculas bioactivas que poseen alguna característica beneficiosa para el ser humano. La mayoría de estas moléculas se pueden encontrar en una dieta equilibrada en cantidades suficientes para ejercer su función beneficiosa. Otras, sin embargo, hay que introducirlas exógenamente.

Uno de los lugares donde la humanidad ha buscado tradicionalmente las moléculas que se adicionan exógenamente a todos esos productos comerciales son las plantas. Por ello, una de las estrategias más usadas para la obtención de compuestos bioactivos es la identificación, extracción y maximización de la producción de metabolitos de plantas. Entre estos compuestos bioactivos podríamos citar a estilbenos, vitaminas, ácidos grasos, etc.

Como muchas de estas biomoléculas son generadas en respuesta al estrés que sufren las plantas (por ejemplo, ante el ataque de un patógeno), los investigadores simulan estas condiciones para maximizar la producción. Una de las estrategias más utilizadas, llamada elicitación, es la adición de Metil Jasmonato (MeJA) a los cultivos celulares. El MeJA es una molécula señal que desencadena una cascada de reacciones estimulando la síntesis de gran cantidad de compuestos activos.

El problema que presenta MeJA es que se vende comercialmente como una muestra racémica de sus cuatro isómeros y recientes estudios han sugerido un distinto efecto estimulante para cada uno de sus isómeros. Esto se traduce en que si se elicitara solo con el isómero más activo, en lugar de con toda la mezcla, podríamos obtener un producto limpio que evitaría posteriores etapas de purificación.

Por esta razón en el grupo de investigación donde desarrollo mi tesis (Bioquímica y Biotecnología enzimática) nos propusimos separar e identificar los 4 isómeros de MeJA mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

El HPLC es un tipo de cromatografía en columna utilizada, principalmente, para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. La muestra a analizar pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente llamada columna) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. Dicha muestra es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente, dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria, a medida que atraviesan la columna.

El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluído de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

Para la separación del MeJA se introdujo en la fase móvil un agente complejante llamado ciclodextrina (CD). Las CDs son oligosacáridos cíclicos formados por unidades de glucosa unidas por enlaces α(1→4). Las más comunes son la α, β, y γ-CD que contienen 6, 7 y 8 unidades de glucosa, respectivamente. La característica más importante de las CDs es su capacidad para encapsular en su interior diferentes moléculas hidrofóbicas. Debido a las versátiles propiedades de las ciclodextrinas son usadas ampliamente por diversas industrias para solubilizar y estabilizar compuestos, proteger fármacos, enmascarar sabores, liberación controlada de compuestos bioactivos, etc.

La función de las CDs en la fase móvil de nuestro HPLC es “atrapar” con distinta afinidad a los 4 isómeros del MeJA y así lograr separarlos. Según la capacidad de las CDs para encapsular cada uno de los isómeros se retendrá más o menos en la fase estacionaria. Mediante ajustes matemáticos a modelos de encapsulación previamente establecidos podremos no solo separar los 4 isómeros del MeJA sino obtener las 4 constantes de encapsulación de cada uno de ellos en las CDs.

De entre todas las CDs probadas en nuestro estudio, metil-beta-ciclodextrina (un derivado de beta-CD), fue la que mayor constante resultó tener. Además, y a diferencia de las otras CDs empleadas, logró la separación parcial de la muestra en 3 picos cromatográficos… pero no lo los 4.

Estos resultados nos llevaron a pensar que metil-beta-ciclodextrina era capaz de separar los 4 isómeros de MeJA pero que había que perfeccionar el sistema. Por ello nos pusimos a investigar distintas condiciones de trabajo que nos permitieran obtener los 4 picos cromatográficos correspondientes a los 4 isómeros del MeJA. En el proceso de optimización usamos distintas fases móviles con diferente concentración de disolvente orgánico (20-40% de metanol); distintas cantidades de Metil-β-CD (0-16 mM), diferentes temperatura (de 5 a 60 °C), varios tipos de fase estacionaria y de caudal, etc.

Tras mucho trabajo logramos separar los 4 isómeros del MeJA. Las condiciones óptimas fueron: una concentración de metanol en la fase móvil del 20%, una temperatura de 45º C, una concentración de Metil-β-CD de 16 mM, una fase estacionaria formada por una columna C18 de 250 mm y un caudal de 1.25 mL/min.

¿Trabajo acabado? No. Aún quedaba lo más difícil: identificar qué pico cromatográfico correspondía a cada isómero. Ante la ausencia de patrones comerciales de cada uno de los isómeros, decidimos emplear la bioinformática y utilizar técnicas in silico de docking molecular. Estas técnicas permiten predecir la fuerza con la que una molécula huésped atrapa a un ligante. Para la identificación de los picos también empleamos coinyecciones de aceite de romero, una fuente pura de (-)MeJA.

Los modelos bioinformáticos empleados dieron lugar a la siguiente predicción: el pico 1 corresponde al (-) epiMeJA; el pico 2 al (-) MeJA; el pico 3 al (+) MeJA y el pico 4 al (+) epiMeJA. Investigación acabada.

En resumen, en este artículo hemos visto cómo el uso de Metil-β-CD como aditivo en la fase móvil de un sistema de HPLC es una buena opción para la separación de los 4 isomeros del MeJA. Por otro lado, la bioinformática es una gran herramienta para la identificación de esos isómeros. Los resultados constituyen un primer paso para la mejora de cultivos celulares elicitados y la purificación a gran escala de cada isómero.

Más información

Bibliografía: Matencio, A; Bermejo, M;García-Carmona, F. and López-Nicolás, J.M.. Separating and Identifying the Four Stereoisomers of Methyl Jasmonate by RP-HPLC and using Cyclodextrins in a Novel Way. Phytochem Anal. 2016. doi: 10.1002/pca.2654

Adrián Matencio